En 1535 tomará parte de la expedición al Río de la Plata -dirigida por Pedro de Mendoza- con los cargos de alguacil mayor y mayordomo. En esta expedición se fundará
Buenos Aires. Ayolas continuará las expediciones por la zona, explorando los ríos Paraná y Paraguay, fundando en las orillas de este último la ciudad de Candelaria donde dejó como lugarteniente a Irala. Ayolas partió para el Chaco y recorrió la región de Charcas, siendo recibido cordialmente por los indios caracaráes. Cuando regresó a Candelaria se encontró con al ciudad abandonada y fue atacado por los indígenas, falleciendo en el ataque.